Großpraktikum I 2009

   Zusammenfassung

   Einleitung

   Material & Methoden

   Ergebnisse

   Diskussion

   Literatur

Zusammenfassung

Im Rahmen des Mikrobiologischen Großpraktikums I sollten verschiedene  Methoden zur Erfassung der Identität, Quantität und Aktivität von Mikroorganismen erlernt werden, welche sich an dem ”Full Cycle 16S rRNA Approach” (nach Amann et al., 1995) ausrichteten. Dazu wurden Wasserproben entlang eines Salinitätsgradienten der Warnow untersucht. Zum Einsatz kamen sowohl „klassische“, als auch molekularbiologische Methoden. Über Zellzahlbestimmungen, Keimzahlbestimmungen, Isolierung von Mikroorganismen auf selektiven Nährmedien, 16S rRNA SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) und Klonierung, sowie der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) wurden mikrobielle Diversitäten und Quantitäten untersucht. Die Untersuchungsgebiete erstreckten sich hierbei von der Warnow-Eisenbahnbrücke mit einem Salzgehalt von 0,3 ‰, über Marienehe (3,5 ‰) bis nach Warnemünde mit einer Salinität von 7,9 ‰. Wir erwarteten, dass sich die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft mit zunehmender Salinität ändert. Dieses wurde mit den angewendeten Methoden bestätigt. Außerdem konnte eine Abnahme der Thymidin- und der Leucinkorporation der Organismen mit zunehmendem Salzgehalt detektiert werden.

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Einleitung

Im Rahmen dieses Praktikums untersuchte eine Gruppe von Studenten der Universität Rostock am IOW die Zusammensetzung der aquatischen Mikroorganismengemeinschaft entlang des Salzgradienten der Warnow. Die Diversität in diesem noch wenig untersuchten Ökosystem ist sowohl durch limnische als auch marine Mikroorganismen geprägt, die je nach Probenstandort den unterschiedlichen Einfluss des Salzwassers der Ostsee bzw. des Süßwassers aus der Warnow auf die Gemeinschaft des jeweiligen Standorts aufzeigen.
Ziel dieser Untersuchungen war es, einen Überblick über die vorkommenden Mikroorganismengruppen zu bekommen, Dominanzen einzelner in Abhängigkeit von bestimmten Standortparametern zu ermitteln und Aussagen über ihre Rolle in dem jeweiligen Ökosystem zu treffen. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf den Untersuchungen der bakteriellen Gemeinschaft und der der heterotrophen Protisten.
Als Standorte für die Probenentnahme wurden drei Bereiche unterschiedlicher Salinität ausgewählt. Nach der Salinitäts- und Temperaturbestimmung vor Ort wurden im Labor verschiedene Nährstoffuntersuchungen an den Wasserproben durchgeführt, um einen Überblick über die Lebensbedingungen für die Mikroorganismen am jeweiligen Standort zu erhalten.
Zur Abschätzung der Quantität und Diversität der untersuchten bakteriellen Gemeinschaft wurden verschiedene „klassische“ und etablierte molekularbiologische Techniken parallel angewandt.
Mit Hilfe der Epifluoreszenzmikroskopie wurden Aussagen über die morphologische Diversität durch Färbungen mit den Nukleinsäurefarbstoffen DAPI und SYBR Green I und über die phylogenetische Diversität durch Anwendung der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) getroffen. Die Zellzahlbestimmung der Bakterien erfolgte sowohl durch klassische Zählung am Mikroskop als auch durch Messungen am Durchflusszytometer.
Durch Kultivierungsversuche wurden Keimzahlen bestimmt und Aussagen über Koloniemorphologien und Zellmorphologien  gemacht.
Nach Vervielfältigung der aus den Bakterienzellen extrahierten 16S rDNA mittels PCR wurden diese durch die genetischen Fingerprintmethoden SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) und DGGE (Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese) aufgetrennt. Durch Digitalisierung und anschließende densitometrische Analyse der Gelbilder wurden Aussagen über die Diversitäten der verschiedenen untersuchten Standorte getroffen und vergleichende Clusteranalysen angestellt.
Außerdem wurden Klonierungen mit den aus den Umweltproben extrahierten DNAs durchgeführt. PCR-Produkte ausgewählter Klone wurden dann mit Restriktionsenzymen verdaut und einer RFLP-Analyse unterzogen.
Die aufgereinigten PCR-Produkte einiger dieser Klone und einiger auffälliger, isolierter Kolonien aus den Kultivierungsversuchen sowie Banden aus einigen Fingerprints wurden sequenziert und anschließend am Computer phylogenetisch ausgewertet. Dadurch konnten Aussagen über, an bestimmten Standorten dominante, Bakteriengruppen getroffen werden.
Des Weiteren wurden durch Untersuchungen der Stoffwechselaktivität mit der CTC-Methode (Bestimmung der respiratorischen Aktivität mit dem in oxidierter Form farblos vorliegendem Farbstoff 5-Cyto-2,3-Ditolyl-Tetrazoliumchlorid) sowie der bakteriellen Produktivität durch die Messung der Inkorporation von radioaktiv markiertem Thymidin bzw. Leucin wichtige vergleichbare Kernaussagen über die Gesamtbakterienpopulation der einzelnen Standorte getroffen.
Insgesamt konnten allgemeine Aussagen über Abundanz, Biomasse, Aktivität und Produktivität an den drei Standorten entlang des Salzgradienten der Warnow gemacht werden. Des Weiteren gelang es detailliertere Informationen über bestimmte Bakterien der einzelnen Standorte zu gewinnen und damit Aussagen über die allgemeine Struktur der Mikroorganismengemeinschaften in dem jeweiligen Standortwasser zu machen.

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Material & Methoden

Probenahme:

Die Wasserproben wurden an drei verschiedenen Standorten der Warnow entnommen. Je Standort wurden ca. 10 l mit einem Eimer geschöpft und vor Ort durch 100 µm Gaze gefiltert.

Abbildung 1: Rostock mit den drei Beprobungsstationen (http://commons.wikimedia.org)

Phyiko-chemische Untersuchungen:

Chemische Profile von Salinität, Phosphat, Nitrit, Nitrat, Ammonium und Silikat wurden durch die Abteilung Chemie bestimmt.

Flow Cytometer:

Für die Flow Cytometer Analyse wurden die Wasserproben mit Paraformaldehyd/Glutardialdehyd (P+G) für Bakterien- und Algenmessung und mit CTC für Stoffwechselaktivitätsmessung fixiert. Die Proben wurden 10x mit Milli-Q Wasser verdünnt, für 15 min mit SYBR-Green gefärbt und in einem Becton & Dickinson FACScalibur gemessen. Die Durchlaufgeschwindigkeit der Proben lag bei 8,3 µl*min-1für Bakterien und Algen und bei 35 µl*min-1 für die Stoffwechselaktivität. Rot-grüne Latex beads wurden als Standard genutzt. Bakterien wurden durch side scatter (SSC) gegen grüne Fluoreszenz (FL1) grafisch detektiert, Stoffwechselaktivität durch rote Fluoreszenz (FL3) gegen orange Fluoreszenz (FL2) und Algen durch FL3 gegen FL2 und FL3 gegen SSC.

Utermöhl-Methode:

Für die Zellzahlbestimmung wird die Wasserprobe mit Lugolscher Lösung fixiert. 10 ml sedimentierte Probe wird unter dem Umkehrmikroskop Axiovert S100 (Zeiss) bei 200x Vergrößerung ausgezählt.

Produktivitätsmessung / Aktivitätsmessung:

Die bakterielle Produktivität und Aktivität wurde mittels Thymidin- und Leucininkorpoation bestimmt. Die Methode beruht auf der Messung des Einbaus von Thymidin in die DNA der Bakterien und des Abbaus von Leucin. Es wird damit über die Syntheserate der DNA auf die Zellteilungsrate (Vermehrungsrate) der Bakterien geschlossen. Für die In situ Inkubation werden je Lösung ([3H]-Thymidin / ([14C]-Leucin) 6 Scintillationsgefäße benötigt. In 6 Gefäße kommt 50µl [3H]-Thymidin-Lösung (entspricht einer Endkonzentration von ca. 10 nM) und in 6 weitere Gefäße kommt 50µl [14C]-Leucin- Lösung (entspricht einer Endkonzentration von ca. 100nM).  In je 3 der 6 Gefäße werden 100µl Formalin gegeben (Blindwert).
In die anderen 3 Gefäße kommen 10 ml frisches Probenwasser. Die Probengefäße werden gut geschüttelt und dann für 60 min dunkel inkubiert. Durch Zugabe von 100µl Formalin je Probengefäß wird die Inkubation beendet (kein Formalin zu Blindwerten).  Die inkubierten Proben werden durch 0,2µm Polycarbonatfilter mit einem Vakuum von < 0,2 bar filtriert. Die Probengefäße und die Filtrationstunnel werden mit einkalter 5%iger TCA (Trichloressigsäure) gespült. Die getrockneten Filter  werden anschließend mit einer Pinzette in ein kleines Scintillationsgefäß, mit 4 ml Scintillationsflüssigkeit gegeben und bis zur Messung der Radioaktivität im LSC (Flüssigkeitsscintillationsmeßgerät) mindestens über Nacht stehen gelassen.

Nukleinsäureextraktion:

Um in der PCR Nukleinsäuren als sog. Template einsetzen zu können, ist es erforderlich, diese relativ unbeschädigt aus den Zellen zu isolieren. Der Zellaufschluss findet mittels Beadbeater statt. Dafür werden je 3 2 mm- und 3 mm-Zirkoniumperlen, 500 µl Phenol/Chloroform 8:1 (pH 7,5) und  500 µl SDS-Extraktions-Mix in das Reaktionsgefäß mit dem DNA-Filter überführt. In einem Beadbeater wird die Probe 2 min geschüttelt (bei 2.000 rpm), 30 sec gewartet und eine weitere Minute geschüttelt. Zirkoniumperlen werden in der Zentrifuge abzentrifugiert (5 min, 14.000 rpm, 4°C). Der wässrige Überstand wird in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gestellt. Im Anschluss kommt es zur Phenol/Chloroform Reinigung. Zu der Aufzureinigenden Nukleinsäurelösung werden das einfache Volumen an Phenol/Chloroform (pH 7,5) hinzupipettiert. Nach einer Inversion (10 x) und einer Zentrifugation (5 min, 14.000 rpm, 4°C), wird die wässrige Phase in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die organische Phase und die Interphase beinhalten die Proteine und Huminsäuren und werden verworfen (Sondermüll!). Der Probe wird als letztes das einfache Volumen an Chloroform zugegeben und die Probe erneut wie oben beschrieben gemischt und zentrifugiert (5 min, 14.000 rpm, 4°C). Der nun erhaltene wässrige Überstand, der die gereinigten Nukleinsäuren enthält, wird in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Zum Schluss wird die Probe einer Ethanol- Fällung unterzogen. Der Probe wird das 2,6-fache Volumen des Fällungsmixes beigefügt und zur Verbesserung der Fällung 1,3 µl Glykogen hinzupipettiert. Bei -80 °C  innerhalb 1h gefällt und zu einem Pellet abzentrifugiert (45 min, 14.000 rpm, 4°C). Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und 1000 μl 70 %iges Ethanol zum Waschen auf die Proben gegeben. Es folgt eine erneute Zentrifugation (5 min, 14.000 rpm, 4°C). Der Überstand wird verworfen und ein weiteres Mal mit 750 µl Ethanol gewaschen. Nach der abschließenden Zentrifugation (5 min, 14.000 rpm, 4°C) und der möglichst kompletten Abnahme des Ethanol-Überstands werden die Reaktionsgefäße bis zur vollständigen Trocknung der enthaltenen Nukleinsäure- Pellets in der Speed Vac zentrifugiert), wodurch das restliche Ethanol entfernt wird. Die DNA wird nach der Trocknung in 60 μl DEPC-H2O aufgenommen. Nach einer Inkubation von 30 min bei Zimmertemperatur (zur Resuspension der DNA) erfolgt die Quantifizierung  der erhaltenen Nukleinsäuren per Nanodrop-Messung. Dafür wird 1 µl der gelösten DNA bei einer Wellenlänge von OD = 260 nm spektrophotometrisch vermessen. Proben, die längere Zeit nicht benötigt werden und dementsprechend gelagert werden sollen, werden bei - 20 °C eingefroren.

FISH:

Die Fluoreszenz- in- situ- Hybridisierung basiert auf der Basenpaarung von markierten DNA- Sonden mit ihren komplementären DNA- Zielsequenzen. Es wurden 2,0- 5,0 ml- formolfixiertes Warnowwasser auf einem 47mm  und 0,2µm Isoporen- Filter mit 200 mbar abfiltriert und für die Hybridisierung in Tortenstücke zerteilt. Pro Filterstück für den Hybridisierungsmix, werden 2 µl Probenarbeitslösung (SONDE) zu 19 µl Hybridisierungspuffer  (MilliQ- HO, 5M NaCl, Tris- HCl, Formamid, SDS 10%ig) in einem Soft- Tube gemischt. Für die Hybridisierung wurden Alpha, Beta, Gamma, EUB und Cytophaga- Sonden eingesetzt. Die Inkubationsdauer beträgt 90 min bei 48°C. In einem vorgewärmtem Waschpuffer (5M NaCl, 1M Tris/ HCl, 0,5M EDTA, SDS 10% ig, dest. Wasser) werden die Filter für 10 min bei 48°C inkubiert und dann mit MilliQ- HO nachgespült. Die getrockneten Filter werden in einem DAPI- Citiflour- Vectashield- Gemisch auf einem Objektträger eingebettet und mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Zeiss)(Filtersätze für DAPI und Cy3) mikroskopiert.

DAPI:

Es wurden 2,0- 10,0 ml Glutaraldehyd fixierte Wasserprobe mit 200mbar auf einem 0,8µm Polycarbonat abfiltriert und danach mit 1,0 ml DAPI- Lösung 1 min inkubiert. Die DAPI- Lösung wurde im Anschluss abfiltriet und der Filter gespült. Am Epiflourszenzmikroskop (Zeiss) wurden die Bakterien, Picoalgen und Nanoflagellaten mittels eines Rasters ausgezählt.

Klonbibliothek und RFLP:

Zur Untersuchung der mikrobiellen Diversität werden bakterielle bzw. universelle Primer (27f-1492r) eingesetzt. Dabei wird ein Fragment von ca. 1470 bp erwartet.

Um ausreichend PCR-Produkt für eine erfolgreiche Klonierung zu erhalten, werden 50 µl-Ansätze pipettiert, die nach anschließender Amplifikation aufgereinigt werden. Negativkontrolle nicht vergessen!!

Der Thermozyklus beginnt mit einer Initialen Denaturierung für 5 min bei 94°C. 30 Zyklen bestehen aus 60 sec 94°C, 45sec 45°C und 90sec 72°C mit einer 20 min langen abschließenden Elongation bei 72°C. Nach der Aufreinigung der PCR- Produkte mit dem NucleoSpin® Extract II Kit (Macherey & Nagel) kommt es zur Ligation mit dem Klonierungskit der Firma Promega. Für die Ligation (2xRapid Ligations Buffer, pGEM- Teasy 50ng/µl, T4 DNA Ligase 3U/µl, DEPC- Wasser) unseres PCR- Produktes werden 70 ng DNA eingesetzt. Die Ligation erfolgt durch eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Für die Transformation werden kompetente JM 109- Zellen (E. coli) verwendet. Von der Bakteriensuspension werden 50µl abgenommen und mit 2µl des Ligationsansatz gemischt und 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wird das Gemisch 45 sec bei exakt 42°C (Thermomixer) einer Hitzeschockbehandelung unterzogen. Danach kommen die Zellen sofort für 2 min auf Eis. 1000µl SOC- Medium zugeben und 45 min bei 37°C inkubieren. Im Anschluss werden 100µl pro LB- Amp- Platte (20µl X- Gal, 100µl IPTG) ausplattiert, mit Parafilm verschlossen und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Für die Kolonie- PCR werden die weißen Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher angepickt und in ein steriles, mit 20µl DEPC- Wasser gefülltes Tube gestellt. Die Ansätze werden 10 min in einem Wasserbad gekocht und anschließend zentrifugiert.

Zum Nachweis des Inserts wird die Primerkombination SP6 und T7 verwendet. Diese Standardprimer sind auf dem Vektor lokalisiert (flankieren die Multicloning-Site). Das Fragment wird ca. 200 bp größer sein, als das ursprüngliche Insert.

Der Thermozyklus beginnt mit einer Initialen Denaturierung für 5 min bei 94°C. 30 Zyklen bestehen aus 60 sec 94°C, 45sec 45°C und 120sec 72°C mit einer 10 min langen abschließenden Elongation bei 72°C. Nach der Reaktion werden 4 µl des Ansatzes im Agarosegel überprüft. Bei den positiven Klonen sollte ein Fragment mit der errechneten Größe (ca. 1,6 bp) nachweisbar sein. Die PCR-Produkte werden anschließend einem Restriktionsverdau mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen unterzogen. Diese Enzyme erkennen eine spezifische DNA-Sequenz und schneiden dort auch. Wir verwenden für die RFLP-Analyse die 4er-Cutter MspI und Hin6I. Der PCR-Ansatz braucht vor dem Verdau nicht aufgereinigt zu werden. Für den Restriktionsverdau werden die Ansätze für 90 min bei 37°C im Thermoncycler inkubiert.

Bei der RFLP-Analyse handelt es sich um ein relativ einfaches Fingerprintverfahren, bei der Sequenzunterschiede in den Restriktionsschnittstellen zu verschiedenen Bandenmustern führen.

Anhand der Bandenmuster können die einzelnen Klone zu sogenannten OTUs (operational taxonomic units) zusammengefasst werden. Da die auftretenden DNA-Fragmente recht klein sind, und auch untereinander teilweise recht geringe Größenunterschiede aufweisen, werden für die RFLP-Analysen 3%ige Agarosegele verwendet. Dazu wird 0,5% TBE-Puffer mit 3% Agarose aufgekocht und anschließend gegossen. Nach der erfolgten Polymerisation wird das gesamte verdaute PCR-Produkt aufgetragen und aufgetrennt. Links und rechts wird ein Standard aufgetragen. Die Auftrennung erfolgt für 90 min bei 100V in 0,5% TBE. Die Gele werden anschließend 40 min im Ethidiumbromidbad gefärbt und danach 15 min im Wasserbad gewaschen. Die dabei übrig gebliebenen Produkte werden einer erneuten PCR unterzogen und aufgereinigt.

1 µl des Eluats anschließend im Agarosegel überprüfen und die Konzentration mittels Nanodrop- Messung bestimmen.

Alle Klone mit mindestens 10,0 ng/µl DNA wurden zur Sequenzierung geschickt.

SSCP:

Die Amplifizierung der 16S rDNA erfolgt mit den durch Schwieger und Tebbe (1998) beschriebenen bakteriellen Primern COM1f und COM2rpH (amplifizieren den Bereich 519- 926 des E. coli 16S rRNA Genes). Der Thermozyklus beginnt mit einer Initialen Denaturierung für 3 min bei 94°C. 30 Zyklen bestehen aus 60 sec 94°C, 60sec 50°C und 90sec 72°C mit einer 4 min langen abschließenden Elongation bei 72°C. Die Synthese der ssDNA wie auch die SSCP- Analyse werden entsprechend nach Schwieger und Tebbe (1998) durchgeführt. Die 16S rDNA wird mittels der Lambda Exonuklease     (5U/µ, Biozym) verdaut, um eine Einzelstrangherstellung zu gewährleisten. Die Inkubation der 16S rcDNA mit der Lambda- Exonuklease erfolgt bei einer Temperatur von 37°C im Thermomixer  (TS- 100, Kisker) für eine Zeitdauer von 2h und wird bei einer Temperatur von 4°C gestoppt. Im Anschluss wird die 16S rcDNA sowie die ssDNA mittels NucleoSpin® Extract II Kit (Marcerey- Nagel) aufgereinigt. 100ng der Aufgereinigten einzelsträngigen 16S rcDNA sowie 2µl des 1kb DNA- Standards (GeneCraft) werden mit 4µl Ladepuffer vermischt und vor dem auftragen auf das SSCP- Gel (MilliQ- Wasser, 5x TBE- Puffer, MDE- 2 Lösung, APS 10%, TEMED) 3 min bei 95°C im Thermomixer (Compact, Eppendorf) erhitzt und sofort für 10 min im Eisbad abgekühlt. Bei einer konstanten Spannung von 400 Volt und einer Kühltemperatur von 20°C beträgt die Laufzeit 16 bis max. 18 h.  Das Gel wird  mittels Silberfärbung entwickelt, dabei bilden die Silber- Ionen (Ag) mit der DNA einen Komplex. Anschließend wird das Silber durch die Zugabe alkalischen Formaldehyds reduziert und fällt aus. Die entwickelten Banden erscheinen braun bis schwarz.

DGGE:

Es wird ein 50 µl PCR- Ansatz mit dem 385f GC und 907r Primern angesetzt. Der Thermozyklus beginnt mit einer Initialen Denaturierung für 5 min bei 34°C. 10 Zyklen bestehen aus 60 sec 95°C, 60sec 65°C und 180sec 72°C, innerhalb der 10 Zyklen sinkt die Temperatur auf 55°C. den 10 Zyklen folgen 18 Zyklen bestehend aus 60 sec 95°C, 60 sec 55°C und 120sec 72°C mit einer 5 min langen abschließenden Elongation bei 72°C. Zur Überprüfung der Funktionalität der PCR sollte ein 2%iges Agarosegel geladen werden. Für die DGGE müssen zunächst eine 0%ige (Acrylamid 40%, TAE 50x, Wasser) und eine 80%ige (Acrylamid 40%, TAE 50x, Formamid, Harnstoff, Wasser) Harnstoff- Formamid- Stammlösung (UF) mit jeweils einer PAA- Konzentration von 9% hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Stammlösung werden nun die Lösungen für Gele mit dem gewünschten Gradienten von 0- 80% UF gemischt (2x25ml),  z.B. 30% UF und 70% UF Gradient 30- 70% UF. Die benötigten Volumina der Stammlösungen können beliebig per Dreisatz errechnet werden. Die beiden Gel- Lösungen unterschiedlicher UF- Konzentration ( für je ein Gel) werden mit 100ml APS (10%) und 10ml TEMED zur Polymerisation versetzt, und direkt anschließend in die Mischapparatur gegossen. Dabei wird die Höherprozentige Lösung in den mit der Peristaltikpumpe verbunden Zylinder gegeben. Das Ventil zwischen den beiden Gefäßen wird erst nach Anschalten der Pumpe geöffnet. Die Kanüle am langen Schlauch wird zwischen die Glasplatten geschoben. Es ist darauf zu achten, dass der Magnet in dem mit der Pumpe verbundenen Zylinder bei niedriger Drehzahl rührt. Nach einer Polymerisationszeit von mind. einer Stunde kann das Sammelgel gegossen werden.     Es werden 10 ml der 0% UF- Stammlösung mit 100µl APS und 10µl TEMED versetzt. Die Lösung wird gemischt und mit einer Glaspipette auf das Trenngel (Gradientengel) gegeben. Nach frühestens 10 min kann der Gelkamm entfernt werden. Nachdem der Gellkamm entfernt ist, sollte die Apparatur umgehend in den Puffertank überführt werden. Die bereits mit Ladepuffer versetzten Proben werden in die Geltaschen des DGGE- Gels pipettiert. Dabei sind die Proben zum Vergleich neben einem Marker aufzutragen. Nach dem Verschließen der Pufferkammer erfolgt die Gelelektrophorese zunächst für 10 min bei einer Spannung von 200V und anschließend für 16h bei einer Spannung von 100V. Danach wird das Gel in einer Ethidiumbromidlösung für mindestens 30 min gefärbt. Die anschließende Auswertung und Dokumentation erfolgt mit Hilfe eines Geldokumentationssystems unter UV- Licht.

Kultivierung:

Für die Kultivierung werden je  900 µl filtriertes und autoklaviertes Warnowwasser in 2 Eppendorf- Tubes gegeben und für eine Verdünnungsreihe (1:10, 1:100, 1:1000) eingesetzt. In je drei Parallelen werden 100 µl auf Ostseewasseragarplatten und auf NB- Mediumplatten mit einem Drigalskyspatel ausgestrichen (unter Clean bench). Platten mit Parafilm schließen und umdrehen. Bebrütung bei Raumtemperatur. Nach etwa 1- 2 Wochen wird die Keimzahlen bestimmt und abundante Ostseeisolate auf MB-Festmedien ausgestrichen (Dreistrichverfahren). Bebrütung bei Raumtemperatur.

Mittels Phasenkontrastmikroskopie können Isolate aus Flüssigkultur heraus auf Agarobjekträgern analysiert werden. Dabei können Kolonien anhand ihrer Morphologie unterschieden werden.

Phylogenetische Analyse:

Ausgewählte Stämme, Klone oder Banden aus Fingerprints werden sequenziert und phylogenetisch über die Programme Seqman und ARB ausgewertet und in einen Stammbaum eingeordnet.

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Ergebnisse

Physiko-chemische Struktur:

Die Salinität steigt von der Probestelle Warnow bis Warnemünde von 0,3 auf 7,9 ‰ an. Auch die Ammonium-Konzentration steigt nach Warnemünde von 0,71 auf 1,75 mol/l an (Abb. 2a). Die Silikat-Konzentration hingegen sinkt in Richtung Mündung von 135,1 auf 59,1 mol/l, ebenso sinkt die Tempeartur von 11 auf 7,9 °C (Abb. 2b).

a

b
Abbildung 2a, b: Chemische Profile der drei Standorte

Quantitätsmessungen:

Die bakteriellen Gesamtzellzahlen wurden durch die Flow-Cytometer Methode, FISH und DAPI bestimmt. Die Zellzahlen liegen im Bereich von 2*10⁶ bis 8*10⁶ Zelle*ml^-1 (Abb. 3). Durch alle Methoden war eine Zunahme der Zellzahl zur Mündung hin feststellbar, lediglich die Flow-Cytometer Messung der Probe aus Warnemünde weicht von diesem Trend ab.

Abbildung 3: Gesamtzellzahl ermittelt durch Flow-Cytometer Messungen, FISH und DAPI an den drei Standorten

Diversitätsbestimmungen:

Untersuchungen mit der FISH-Methode zeigten , dass alle untersuchten bakteriellen Großgruppen an allen Standorten zu ermitteln waren. Der prozentuale Anteil der Betaproteobakterien war in allen Proben in etwa gleich, wohingegen die anderen Phyla variierten (Abb. 4).

Abbildung 4: Prozentuale Verteilung der bakteriellen Großgruppen an den 3 Standorten (Bildquellen v. o. n. u.: genome.jgi-psf.org, zum.de, garvey.com, microbewiki.kenyon.edu)

Es konnten 32 Mikroorganismen aus Isolaten und Klonbibliotheken anhand ihrer 16S rDNA differenziert werden (Abb. 5). In der Warnow gehörten 50% dem Phylum Bacteriodetes an, 20% den Proteobakterien, wobei keine Gammaproteobakterien nachgewiesen wurden, und jeweils 10% den Verrucomicrobia, Actinobakterien und Firmicutes. In Marienehe gehörten 54% den Bacteriodetes an, 31% den Proteobakterien und 15% den Actinobakterien. In der Warnowmündung gehörten 62% den Proteobakterien an, 25% den Firmicutes und 13% den Actinobakterien.

Abbildung 5: Durch das Programm ARB erstellter Stammbaum mit phylogenetischen Beziehungen der sequenzierten Bakterien

Aktivitätmessung:

Die Untersuchung der Thymidininkorporation (Tab. 1), ausgehend von der ermittelten Gesamtzellzahl aus der Durchflusszytometriemessung, zeigt eine Steigerung der bakteriellen Verdopplungszeit von 21,35 h an der Mündung über Marienehe bis 11,55 h an der Oberwarnow. Die bakterielle Kohlenstoffproduktion folgt ebenfalls diesem Trend und steigt von 1,518 µg C*l^-1h^-1 auf 4,24 µg C*l^-1h^-1 an. Die bakterielle Proteinproduktion schwankt zwischen 5,63 µg C*l^-1h^-1 und 2,48 µg C*l^-1h^-1.

Tabelle 1: Bakterielle Aktivitätenan den drei Standorten, gemessen durch radioaktive Thymidin- und Leucininkorporation

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Diskussion

Quantifizierung von Bakterien und Protozoen:

Die ermittelten bakteriellen Abundanzen stimmen mit dem Erwartungswert von 109/l für durchschnittliche Bakterienzellzahlen in Seewasser (Meyer-Reil, L.-A., 2005) überein. Die Bakterien-abundanzen scheinen mit den Mikroalgenabundanzen zu korrelieren; die höchsten Werte für beide Parameter wurden in Marienehe, die niedrigsten im Oberlauf der Warnow bestimmt. Dies ist wahrscheinlich dadurch zu erklären, dass die Bakterien dort die besten Wachstumsbedingungen finden, wo der höchste Gehalt an organischem Material zu finden ist. Eine Bestimmung der POC- und DOC-Gehalte der verschiedenen Wasserproben hätte helfen können, diese Theorie zu überprüfen.
Die Bakterienabundanzen sind darüber hinaus abhängig von dem Fraßdruck durch HNFs. Die HNF-Abundanzen sind in der Warnow am höchsten und nehmen in Richtung Warnemünde ab (für Marienehe wurden nur 3,1%, für Warnemünde nur 1,6% der HNF-Abundanz im Warnow-Oberlauf ermittelt). Dementsprechend nimmt der Fraßdruck vom Standort Warnow zum Standort Warnemünde ab. Die Tatsache, dass trotz geringstem Fraßdruck in Warnemünde nur die zweithöchsten Bakterienabundanzen gefunden wurden, ist möglicherweise mit der geringen Mikroalgenabundanz zu erklären. Der Grazingdruck der HNFs beeinflusst nicht nur die Bakterien- sondern auch die Mikroalgenabundanzen (Kuosa H., Marcussen, B., 1988). Es ist möglich, dass die Mikroalgenabundanzen in Warnemünde trotz des geringsten Fraßdrucks nicht die höchsten aller drei Standorte sind, da dort das Wachstum durch die geringen Phosphatkonzentrationen limitiert wird. Vergleicht man die bakterielle Wachstumsrate mit dem Grazingdruck auf die Bakterien  zwischen den einzelnen Standorten, so scheinen beide Parameter proportional zueinander zu sein. Eine Erklärungsmöglichkeit für diese Proportionalität ist die Erhöhung der bakteriellen Teilungsaktivität durch erhöhten Fraßdruck. Für den Standort Warnow wurde berechnet, dass alle Bakterien in 1/12 ihrer Verdopplungszeit (Tab. 2) aufgefressen werden. Da es jedoch nicht möglich ist, alle Bakterien von HNFs gefressen werden, ist von einer Überschätzung des Fraßdrucks, zumindest für den Standort Warnow, auszugehen. Diese ist möglicherweise bedingt durch eine Überschätzung der HNF-Abundanzen am Standort Warnow oder durch eine generelle Überschätzung der Ingestitionsrate von Bakterien durch die HNFs. Möglicherweise wurden die HNF-Abundanzen aufgrund der Schwierigkeit der Unterscheidung zwischen HNFs und anderen eukaryotischen Zellen, sowie einer ungleichmäßigen Verteilung von HNFs auf dem Filter und eventuell auch im Standortwasser selber, überschätzt.

Tabelle 2: Berechnung des Grazingdrucks der HNFs auf die Bakterien, basierend auf einer durchschnittlichen Ingestitionsrate von 15 Bakterien pro HNF und Stunde. Die Werte für die Bakterienabundanzen stammen aus der  zytometrischen Untersuchung

Vergleicht man die zytometrisch bestimmten bakteriellen Zellzahlen mit den CFU-Anzahlen des jeweiligen Standortes, so wird deutlich, dass auf dem mit Standortwasser hergestellten Medium nur 0,04-0,11% (Mittelwert: 0,06%) und auf dem NB-Medium nur 0,06-0,21% (Mittelwert: 0,11%) der zytometrisch detektierten Zellen auf dem Nährmedium Kolonien bilden. Dieser geringe Anteil an kultivierbaren Zellen ist zu erwarten gewesen, da bekanntermaßen der Anteil an kultivierbaren Zellen an der Gesamtzellzahl in Umweltproben gering ist und häufig weniger als 1% beträgt (Meyer-Reil, L.-A., 2005). Obwohl die Bakterienabundanzen vom Standort Warnow in Richtung des Standortes Warnemünde hin zunehmen, nehmen die Anzahlen an CFUs ab. Dies ist möglicherweise mit der schlechteren Kultivierbarkeit von Bakterien, die an Standorte mit erhöhtem Salzgehalt vorkommen, zu erklären. Beispielsweise könnte es sein, dass es den Bakterien auf dem Kulturmedium trotz der angebotenen chemischen Parameter des Standortwassers (zumindest auf dem Standortwassermedium) weitere Parameter, zum Beispiel physikalischer Art, fehlen, wodurch sie in ihrem Wachstum gestört werden, oder sie wachsen wesentlich langsamer, wodurch sie zur Zeitpunkt der Auszählung noch nicht detektiert werden konnten. Die höheren CFU-Abundanzen auf den NB-Platten im Vergleich zu den mit Standortwasser hergestellten Medien sind mit erhöhten Nährstoffkonzentrationen und vermutlich auch mit der Abwesenheit eventuell inhibierender Verbindungen zu erklären.
Die mikroskopisch ermittelten Bakterienabundanzen sind stets höher als die mit dem Zytometer bestimmten Abundanzen. Aufgrund möglicher Ungleichverteilungen der Zellen auf dem Filter sowie starker Hintergrundfluoreszenz, wie sie beim Auszählen der Zellen beobachtet wurde, ist von einer höheren Genauigkeit der zytometrischen Untersuchung auszugehen. Jedoch ist auch diese Methode anfällig für Fehler, beispielsweise subjektiver Art beim Setzen der Gates.

Der Utermöhl-Untersuchung zufolge stellen Diatomeen den größten Anteil eukaryotischer Einzeller in den Proben dar. Die anhand der mikroskopischen Zählung und der Utermöhl-Untersuchung beobachtete Abnahme der Abundanzen eukaryotischer Einzeller ist also vor allem auf den Rückgang der Diatomeen-Abundanzen in Richtung Warnemünde zurückzuführen. Da die untersuchten Taxa sowohl im limnischen, als auch im marinen Bereich vorkommen, ist die Beeinflussung ihrer Abundanzen durch den Salzgehalt des Standortwassers unwahrscheinlich.
Es ist wahrscheinlich, dass der Rückgang der Diatomeen-Abundanzen einhergeht mit der bzw. den ebenfalls in Richtung Warnemünde abnehmenden Phosphat- oder/und Silikatkonzentrationen. Vermutlich bewirkt  die abnehmende Silikatkonzentration eine Abnahme der Diatomeen-Abundanz. Da die Silikatkonzentrationen keinem direkten anthropogenen Einfluss unterliegen, ist es wahrscheinlich, dass durch einen chemischen Vorgang wie Adsorption oder Komplexierung der Silikationen an bzw. durch eine vor allem an den Standorten Marienehe und Warnemünde vorhandene Verbindung die Silikatkonzentrationen abgesenkt oder die Silikatkonzentration mit zunehmendem  Einfluss des Meerwassers verdünnt und somit die Diatomeen-Abundanz verringert wird. Da die von der Silikatkonzentration weitestgehend unabhängigen Dinoflagellatenkonzentrationen trotz abnehmender Phosphatkonzentration in Richtung Warnemünde zunehmen, ist es wahrscheinlich, dass die Phosphatkonzentration zumindest auf die Abundanz dieses Taxons keinen Einfluss hat. Es ist möglich, dass die Mikroalgen eine geringere Phosphataffinität haben, so dass eine Abnahme der Konzentration ihr Wachstum eher beeinflusst als das der Dinoflagellaten. Ein limitierender Einfluss der Phosphatkonzentration auf die Diatomeenabundanzen, wie er hier für die Mikroalgenabundanzen vor allem in Warnemünde vermutet wird, ist nicht auszuschließen, kann jedoch nicht eindeutig bestätigt werden, da eine Beeinflussung der Diatomeen durch die Silikatkonzentration wahrscheinlicher bzw. größer ist.
Aufgrund der hohen Konzentrationen stickstoffhaltiger Verbindungen an allen drei Standorten, sowie aufgrund der Tatsache, dass in Marienehe, dem Standort der höchsten Stickstoffkonzentrationen, nur die zweithöchste Phytoplanktonkabundanz gemessen wurde, ist anzunehmen, dass das Phytoplanktonwachstum nicht stickstofflimitiert war. Zwar korrelieren die Mikroalgenabundanzen mit den Gesamtstickstoffkonzentrationen, da jedoch am Standort mit der höchsten Stickstoffkonzentration auch die höchsten Cyanobakterienabundanzen (Synechococcen) ermittelt wurden, ist davon auszugehen, dass das Mikroalgenwachstum ebenfalls nicht stickstofflimitiert ist (sonst würden die höchsten Abundanzen stickstofffixierender Cyanobakterien am Standort mit der geringsten Stickstoffkonzentration auftreten).

Untersuchungen zur Aktivität:

Der Anteil an physiologisch hochaktiven Zellen scheint, mit der Ausnahme des Standortes Marienehe, trotz abnehmender Wachstumsrate mit zunehmendem Salzgehalt zuzunehmen. Dafür spricht der steigende Anteil an CTC-positiven Zellen. Die Ausnahme des Standortes Marienehe von diesem Trend ist möglicherweise durch Fehler beim Setzen der Gates bei der zytometrischen Untersuchung oder durch die zufällige und für den Standort nicht repräsentative Dominanz physiologisch weniger aktiver Zellen in den drei Parallelen zu erklären.
Möglicherweise erhöht der osmotische Stress, dem die Bakterien mit ansteigendem Salzgehalt des Standortwassers zunehmend ausgesetzt sind, ihre physiologische Aktivität in einem stärkeren Maß als die Zellteilungsaktivität.
Interessanterweise folgt der Verlauf der bakteriellen Proteinproduktion zwischen den einzelnen Standorten dem Verlauf der Konzentration stickstoffhaltiger Verbindungen im Standortwasser. Es ist nicht auszuschließen, dass die Bakterien in opportunistischer Weise das Vorkommen von Stickstoffverbindungen zur Proteinproduktion nutzen, auch wenn Stickstofflimitation des bakteriellen Wachstums ausgeschlossen wurde. Zur genaueren Untersuchung dieser Hypothese könnte eine Zeitreihe aufgenommen werden, anhand welcher die Veränderung der Proteinproduktion in Abhängigkeit von Schwankungen der Konzentrationen stickstoffhaltiger Verbindungen im Standortwasser (beispielsweise bedingt durch verstärkten Eintrag von Düngerstickstoff nach Regenfällen) analysiert werden könnten.
Die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen der Berechnung der Kohlenstoffinkorporaton in bakterielle Biomasse durch die Thymidininkorporation bzw. durch die Leucin-Inkorporation ist bedingt durch die Annahme eines konstanten zellulären Gehaltes an Kohlenstoff bei der Berechnung durch die Thymidininkorporation, welcher bei einem konstanten Protein-Kohlenstoff-Verhältnis einen konstanten Proteingehalt voraussetzt. Geht man allerdings nicht von einem konstanten zellulären Proteingehalt  aus, widersprechen sich die Ergebnisse beider Berechnungen nicht. Sie sind in ihrer Vergleichbarkeit untereinander begrenzt und können daher eher für den Vergleich der Ergebnisse jeweils einer Berechnung zwischen den einzelnen Standorten genutzt werden.

Untersuchungen zur Diversität und Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften:

Wie aufgrund der an einen Primer angehängten GC-Klammer zu erwarten war, wies das DGGE-Gel für alle Standorte weniger Banden auf als das SSCP-Gel. Die Diversität/Anzahl an Banden nahm auf beiden Gelen wie erwartet mit zunehmendem Salzgehalt des Standortwassers ab, was zusammen mit der Zunahme der bakteriellen Abundanzen um 30,2% für den Standort Warnemünde gegenüber dem limnischen Standort Warnow  die Zunahme der Eveness suggeriert und durch die Analyse des SSCP-Gels bestätigt wurde. Die Ergebnisse der FISH-Untersuchung bestätigen diese Ergebnisse in soweit, als dass im Vergleich zum Standort Warnow für die Standorte mit erhöhtem Salzgehalt eine gleichmäßigere Verteilung der Bakterienabundanzen zumindest über die untersuchten Großgruppen zu beobachten ist.  Darüber hinaus bestätigen auch die Ergebnisse der RFLP-Analyse diese Ergebnisse. Die Anzahl an Bandenmustern, die zu OTU’s zusammengefasst werden können, nahm mit ansteigendem Salzgehalt zu (und das, obwohl für den Standort Marienehe eine geringere Anzahl an Kolonien untersucht wurde als für den Standort Warnow). Zusätzlich nahmen auch die Koloniemorphologien, die für die ausplattierten Verdünnungsreihen bestimmt wurden, mit zunehmendem Salzgehalt ab. All diese Ergebnisse deuten auf die Abnahme der bakteriellen Diversität zugunsten der Zunahme der Abundanzen einiger weniger Taxa mit zunehmendem Standortwasser-Salzgehalt hin.
Vermutlich aufgrund der geringeren Anzahl an detektierten Banden bei der DGGE im Vergleich zur SSCP wurde auf diesem Gel eine weniger deutliche Abnahme der Diversität mit zunehmendem Salzgehalt des Standortwassers beobachtet (Abnahme der Bandenzahl über alle 3 Standorte auf SSCP- bzw. DGGE-Gel: 22,0 bzw. 15,5%).  Verbunden mit der Zunahme der bakteriellen Abundanzen ist vermutlich die Differenz in der Abnahme der Diversitäten für den entgegengesetzten Trend der Eveness auf beiden Gelen verantwortlich. Die Manipulation der rDNA-Sequenzen bei der DGGE durch Anhängen der GC-Klammer sowie die Anwendung verschiedener Primer für die PCRs der SSCP und DGGE, welche in der Untersuchung verschiedener rDNA-Sequenzen auf den Gelen resultiert, limitieren die Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse beider Gele. 

Drei der vier Clusteranalysen zufolge sind sich die Standorte mit erhöhtem Salzgehalt ähnlicher als dem limnischen Standort Warnow. Dieser Befund wird von den Ergebnissen der FISH-Untersuchung gestützt, der zufolge mit zunehmendem Salzgehalt die Gleichmäßigkeit der Verteilung der untersuchten Großgruppen über die Gesamtzellzahl zunimmt. Darüber hinaus sind sich laut der vierten Analyse, die den Standort mit dem höchsten Salzgehalt von den beiden anderen Standorten abgrenzt, die beiden Standorte mit geringerem Salzgehalt untereinander nur wenig ähnlicher als dem dritten Standort. Das legt den Schluss nahe, dass sich die Standorte mit erhöhtem Salzgehalt deutlicher von dem Standort Warnow unterscheiden, als sie sich untereinander unterscheiden.
Sowohl die Pearson-Korrelation als auch die Berechnung der Eveness basieren auf anhand der Gele erstellten densiometrischen Kurven, welche jedoch abhängig sind von der Menge an auf die Lanes aufgetragener DNA. Werden die Lanes verschiedener Standorte mit unterschiedlichen Mengen an DNA befüllt, beispielsweise durch Pipettierfehler, oder sind die Banden bestimmter rDNA-Sequenzen aufgrund eines PCR-Bias dominanter als andere, so hat dies Einfluss auf die Pearson-Korrelation und Eveness und damit auf die Schlüsse, die anhand dieser Parameter bezüglich der Ähnlichkeit der Standorte gezogen werden. Daher ist es angebracht, die Ähnlichkeit verschiedener Proben durch eine Kombination von Parametern zu beschreiben und dabei binäre Koeffizienten wie Jaccard, bei denen nicht die Bandenintensität, sondern nur die An-/ oder Abwesenheit einzelner Banden beachtet wird, zu berücksichtigen.

Gamma-Proteobakterien wurden durch die FISH-Untersuchung für alle Standorte nachgewiesen, wobei - wie es für diese als typisch marin geltende Großgruppe zu erwarten war - für den limnischen Standort Warnow mit Abstand der geringste Anteil an mit der entsprechenden Sonde hybridisierten Zellen detektiert und keine Gamma-Proteobakterien sequenziert wurden.
Die für limnische Standorte charakteristischen Großgruppen der Actino- und Beta-Proteo-bakterien wurden sowohl durch die FISH-Untersuchung als auch die Sequenzierung für alle Standorte nachgewiesen. Es ist wahrscheinlich, dass sich die einzelnen Standorte bezüglich ihrer Salinitäten nicht genug voneinander unterscheiden (maximale Differenz: 0,74%), um stets die erwarteten Abundanzverhältnisse aufzuzeigen, vor allem weil am als marin bezeichneten Standort Warnemünde eine für marine Verhältnisse sehr geringe Salinität von nur 0,79% herrschte.
Abgesehen von der geringen Salinitätsdifferent ist eine weitere Erklärungsmöglichkeit dafür, dass die höchsten Anteile an Beta-Proteobakterien für die Standort mit erhöhtem Salzgehalt bestimmt wurden, die, dass es an diesen Standorten aufgrund des brackigen Charakters des Wassers zu einer Ausflockung von Tonmaterial kommt (Meyer-Reil, L.-A., 2005), wodurch sich dort besonders viele partikelassoziierte Bakterien ansiedeln können. Betaproteobakterien gelten als abundanteste Gruppe partikelassoziierter Bakterien in Fließgewässern (http://www.biology-online.org/articles/fate_heterotrophic_microbes_pelagic/occurrence_microbial_populations_plankton.html).
Der Gesamtanteil an hybridisierten Zellen bei der FISH-Untersuchung ist teilweise größer als 100%, was darauf zurück zu führen ist, dass die dargestellten Werte Mittelwerte dreier Parallelen sind, und vermutlich auch darauf, dass die Großtaxaabundanzen auf den verschiedenen Filterteilen jeder Parallelprobe zumindest geringfügig variieren. Darüber hinaus ist auch von einer leichten Überschätzung der Abundanzen aller Großtaxa auszugehen, da das Auszählen der fluoreszierenden hybridisierten Zellen durch starke Hintergrundfluoreszenz erschwert wurde. Diese Überschätzung betrifft jedoch alle untersuchten Taxa und betrifft die absoluten Abundanzen der einzelnen Großgruppen bei allen Standorten und hat somit keinen Einfluß auf die relativen Abundanzverhältnisse zwischen den einzelnen Standorten.
Die Anteile an mit EUB-Sonden hybridisierten Zellen an der mit DAPI bestimmten Zellzahl entsprechen mit ca. 20 bis 64% dem Erwartungswert von etwa 60%, welcher mit einer Schwankungsbreite von 10-100% in Abhängigkeit vom untersuchten Gebiet und der angewendeten Methode für den Nachweis von marinen planktischen Bakterien mit einer Eubakteriensonde (Meyer-Reil, L.-A.,  2005) gilt.

Obwohl der Anteil an Cytophaga-Bakterien laut FISH-Untersuchung in Warnemünde am höchsten ist, wurden für diesen Standort keine Cytophaga-Zellen sequenziert. Die größte Anzahl an Cytophaga-Sequenzen stammt vom Standort Marienehe, für  den auch der zweithöchste Anteil an mit Cytophaga-Sonde hybridisierten Zellen ermittelt wurde. Alpha-Proteobakterien hatten in Marienehe den größten Anteil an mit der entsprechenden Sonde hybridisierten Zellen, wurden für diesen Standort jedoch nicht sequenziert.
Wahrscheinlich konnten die Sequenzierungen die natürlichen Abundanzverhältnisse der verschiedenen Großgruppen zwischen den einzelnen Standorten, die teilweise auch durch die FISH-Methode untersucht wurden, nicht korrekt wiedergeben, da durch die angewendeten Methoden die Sequenzierung bestimmter Taxa wahrscheinlicher wurde, (PCR-Bias, Selektivität des Agarmediums für Klone) und da die Anzahl an ermittelten Sequenzen zu gering war und daher zufälligerweise für bestimmte Standorte z.B. Sequenzen weniger abundanter Taxa  überrepräsentiert sind.

Für den Standort Marienehe wurde jeweils ein Klon aus zwei der drei OTU’s sequenziert, beide wurden der Flavobakterien/Cytophaga-Gruppe zugeordnet. Klone, deren RFLP-Bandenmuster bei der Analyse nur ein Mal vorgekommen ist, wurden in fast allen Großgruppen gefunden. Dies könnte bedeuten, dass viele der abundanten Arten der Flavobakterien-Cytophaga-Gruppe angehören, oder dass es innerhalb dieser Gruppe nur wenige Arten gibt, die sich an ein Leben im Brackwasser angepasst haben, und daher diese wenigen Arten im Vergleich zu anderen Arten derselben Gruppe am Standort öfter vorkommen.  Ersteres ist unwahrscheinlich, da laut Ergebnissen der FISH- und CARD-FISH-Untersuchung diese Gruppe nach der Gruppe der Aktinobakterien den geringsten Anteil an der Gesamtbakterienzahl hat. Generell ist nicht davon auszugehen, dass die bakterielle Diversität des Standortes durch die RFLP-Analyse von nur 34 Klonen erschöpfend dargestellt ist. Darüber hinaus ist - wie bereits erwähnt - die Anzahl der Sequenzen zu gering, um einen quantitativen Schluss bezüglich der Abundanzverhältnisse der einzelnen Großgruppen zuzulassen.

Differenzen zwischen dem auf ermittelten Sequenzähnlichkeiten und dem auf statistischer Berechnung basierenden Stammbaum sind unter anderem mit dem Einfügen zusätzlicher Taxa für die Bootstrap-Analyse zu erklären. Einige Unterschiede betreffen nicht nur die Ähnlichkeiten zwischen Sequenzen der Datenbank und im Praktikum ermittelten Sequenzen, sondern auch zwischen einzelnen Sequenzen der Datenbank, beispielsweise wird im Bootstrap-Stammbaum die Bacillales-Gruppe nicht als Außengruppe zu den Proteo- und Bacterioidetes-Bakterien, sondern als näher verwandt mit Proteo- als mit Bacterioidetes-Bakterien  angesehen. Da das Bootstrap-Verfahren ein rein statistisches Verfahren ist, kann es zur Unterstützung bestehender, auf ermittelten Sequenzunterschieden oder –ähnlichkeiten basierenden Stammbäumen dienen, sollte jedoch nicht als alleinige Basis zur Aussage über Verwandtschaftsverhältnisse dienen.
Es ist möglich, dass für die Gruppe der Gamma- und Bacillales-Bakterien nur Isolate sequenziert wurden, weil sie besser kultivierbar sind oder schneller wachsen als andere Gruppen, und daher die Wahrscheinlichkeit, eine dieser Kolonien für die Sequenzierung auszuwählen, höher ist. Darüber hinaus ist es auch möglich, dass diese Gruppen sich durch auffällige Koloniemorpholgien auszeichnen und daher bei der subjektiven Auswahl der zu sequenzierenden Kolonien Zellen dieser Gruppen häufiger ausgewählt wurden. Möglicherweise sind Aktino- und Beta-Proteobakterien nur schwer kultivierbar oder sie wachsen langsamer, weswegen von diesen Taxa  nur Isolate sequenziert wurden.

Fazit:

Abschließend lässt sich sagen, dass das Praktikum das Ziel des Erlernens wichtiger mikrobiologischer  Methoden erfüllt hat, zur genauen Untersuchung der mikrobiellen Diversität im Salzgradienten der Warnow jedoch weitere Untersuchungen notwendig sind. Das Entnehmen einer größeren Anzahl an Proben sowie die separate Entnahme von Parallelen sind nötig, um die Untersuchungsergebnisse von der eventuell fleckenhaften Verteilung der Organismen unabhängig zu machen. Die Anwendung verschiedener DNA-Extraktionsmethoden ist nötig, um eine möglichst umfangreiche Erfassung der verschiedenen bakteriellen Taxa der Standorte möglich zu machen, da die Art der Extraktionsmethode beeinflusst, ob die DNA bestimmter bakterieller Gruppen extrahiert wird oder nicht. Die Fingerprint-Analysen sollten mit anderen Primersets wiederholt werden, um den PCR-Bias zu verringern. Die wiederholte Probenahme an unterschiedlichen Tagen zur genaueren Erfassung der bakteriellen Diversität und Aktivitätszustände scheint aufgrund der beobachteten Schwankungen der Salinität und Temperatur im Zeitraum von nur 4 Tagen sinnvoll, da Änderungen dieser Parameter die bakterielle Gemeinschaft beeinflussen können. Aus demselben Grund empfiehlt sich außerdem eine genauere Untersuchung der Änderungen in der bakteriellen Gemeinschaft am gleichen Standort in Abhängigkeit von der Wassertiefe, da innerhalb weniger Tiefenzentimeter auch hier bezüglich Salinität und Temperatur deutliche Änderungen beobachtet wurden.

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Literatur

Amann, R.I.; W. Ludwig; K.-H. Schleifer (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev., 59, 143-169.

Kuosa, H; Marcussen, B. (1988) Grazing of bacteria and phytoplankton by heterotrophic nanoflagelates in a baltic sea sample. Hydrobiologia, 161, 211-216

Meyer-Reil, LA (2005) Microphytobenthic primary production in the Bodden estuaries, southern Baltic Sea, at two study sites differing in trophic status. Aquatic microbial ecology, 41 (2), 181-198

Schwieger F, Tebbe CC (1998) A new approach to utilize PCR-single-strand-conformation polymorphism for 16s rRNA gene-based microbial community analysis. Applied and environmenatl microbiology, 64 (12), 4870-4876

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